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蛋白的磷酸化是生物体内重要的蛋白质修饰类型，会影响到细胞内信号转导、细胞结构、细胞增殖、凋亡、转录、代谢过程以及调控病原微生物的适应能力等等过程，是众多生命过程的关键“开关”。前面我们介绍了磷酸化蛋白组学的研究方法（文章链接：磷酸化蛋白质组学——研究方法），下面就来介绍一下我们拿到磷酸化蛋白质谱定量数据之后常用的分析思路。

基础分析思路

图1 磷酸化蛋白质组基础分析思路

1.磷酸化肽段鉴定及统计

①搜库：

通过TMT、LFQ或DIA拿到原始串联质谱图，利用软件进行搜库。

②校正：

软件分别识别各样本中肽段母离子的峰面积即肽段的相对丰度，然后采用高性能的保留时间对齐算法对来源于不同样本的相同肽段进行对齐，采用样本的总离子流（TIC）进一步对数据进行归一化处理，样本中各蛋白的丰度由原始丰度除以归一化系数获得。

③筛选：

筛选含有至少1条unique肽段，去除掉非磷酸化修饰的肽段，以及不满足阈值范围的磷酸化肽段（如在DIA的Spectronaut分析中，PTMLocalizationProbabilities>0.75为可信度较高的修饰位点）。

④磷酸化肽段统计：

因为磷酸化蛋白的分析是从样品中提取蛋白，酶解成肽段，再富集出有磷酸化修饰的肽段，所以在PP的研究中以肽段为单位进行分析更为准确。

⑤磷酸化蛋白统计：

如果想了解磷酸化蛋白的功能，就要相应的找到磷酸化肽段来源的蛋白，对各样本中磷酸化修饰的肽段来源蛋白的数量进行统计。

⑥磷酸化位点统计：

一个肽段上可能存在多个磷酸化位点，而磷酸化位点会由于非特异性酶切或者漏切导致重复的鉴定和定量，所以在进行位点鉴定数目的统计时，为了保证结果的可靠性，会去冗余合并数据再做位点数目上的统计。此外，由于真核生物中大部分磷酸化来源于丝氨酸（S）、苏氨酸（T）及酪氨酸（Y），会对这三个位点的修饰数量及比列进行统计。

图2 磷酸化肽段鉴定及统计常用图形